Determinación del perfil de isoenzimas lacasa de Pleurotus ostreatus PoB cultivado sobre agar y clonación de fragmentos para silenciamiento de sus genes codificantes

Abstract

Las lacasas (bencenodiol: oxígeno oxido-reductasa, CE 1.10.3.2), son enzimas monoméricas extracelulares, pertenecientes a la familia de las fenoloxidasas que actúan sobre ρ-difenoles. Debido a la baja especificidad por el sustrato, pueden oxidar gran variedad de compuestos de origen natural e industrial. Hasta ahora se han identificado seis diferentes genes y sus correspondientes cADNs: poxc, pox1, poxa1b, poxa3, pox3, pox4 y un pseudogen pox5. En los hongos, inicialmente se pensaba que las lacasas eran producidas sólo para degradar fuentes complejas de carbono. Sin embargo, se han visto involucradas en la síntesis de melanina y la formación del cuerpo fructífero, patogénesis hacia las plantas, conidiación, esporulación, respuestas hacia el estrés, procesos de detoxificación, formación de primordios y rizomorfos. Aunado a lo anterior, se ha observado que en medio líquido con una fuente de carbono de fácil asimilación (glucosa), la producción de lacasas es superior comparada con la obtenida cuando el hongo se cultiva sobre fuentes complejas (paja de trigo), y que el número de isoformas cambia dependiendo de la cepa y las condiciones de cultivo. Por otra parte, de los basidiomicetos que se han secuenciado por completo, el hongo degradador de lignina Phanerochaete chrysosporium no posee genes sensu stricto de estas enzimas. En cambio, el hongo expresa una ferredoxina y varias multicobre oxidasas desconocidas. Por el contrario, pueden reconocerse varios genes de lacasa en basidiomicetes no degradadores de lignina Coprinus cinereus y Laccaria bicolor, con varios perfiles de expresión y funciones desconocidas. Con base en lo anterior la participación de las lacasas únicamente en la descomposición de la lignina es cuestionable. Una estrategia para poder investigar la función de un gen es evitando o disminuyendo su expresión y determinando como es alterado el fenotipo del organismo en estudio durante su desarrollo. Una manera de evaluarlo es utilizando técnicas de biología molecular e ingeniería genética. El RNA de interferencia (iRNA) es una forma de silenciamiento génico pos-transcripcional en el que un RNA de doble cadena (dsRNA) origina la degradación de un mRNA homólogo, de este modo se reduce o suprime la expresión de un gen. El silenciamiento ofrece varias ventajas técnicas para la inactivación de un gen: eficiencia en la recombinación homóloga, induce la supresión de genes en una secuencia específica pero no en un locus específico y principalmente la disminución de los niveles de expresión de un gen particular. Sin embargo a pesar de las virtudes que ofrece la técnica antes mencionada, es primordial antes de llevarla a cabo, contar con los fragmentos específicos en secuencia y tamaño del gen que se desea silenciar para desarrollarla de manera exitosa. En este trabajo, se logró realizar la evaluación del perfil de isoformas en Pleurotus ostreatus PoB, encontrando 3 de ellas tanto extra como intracelularmente, la estandarización de las condiciones de reacción para la amplificación de un gen de lacasa de la cepa Pleurotus ostreatus PoB, se obtuvo la secuencia de un fragmento (517pb) del gen amplificado y una colección de fragmentos de distintos tamaños del gen ligados a un vector de clonación para su posterior amplificación secuenciación y posible inserción en un vector de silenciamiento.