Generación de un marcador molecular tipo PCR-RFLP de Suillus brevipes e Inocybe splendens

Abstract

Los hongos ectomicorrizógenos (HECM) tienen un papel importante en los ecosistemas forestales para el establecimiento y mantenimiento de los bosques templados. Debido a los amplios beneficios que a nivel ecológico y fisiológico obtienen las plantas al formar asociaciones micorrízicas, se han realizado estudios para conocer la diversidad de HECM mediante las técnicas moleculares basadas en el estudio del ADN que combina la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), para identificar a los hongos. En este trabajo se generaron los marcadores moleculares tipo PCR-RFLP de Suillus brevipes e Inocybe splendens. Se realizó la extracción de ADN de las muestras de esporomas y micelio utilizando el protocolo de fenol-CIA, y se amplificó la región ITS del rDNA usando los primers ITS1F e ITS4. Los amplicones se secuenciaron y las secuencias fueron comparadas con las de la base de datos de NCBI mediante BLAST. Los RFLP se generaron mediante la digestión de los fragmentos ITS con las enzimas de restricción AluI, HinfI, BsuRI y EcoRI. Los amplicones y RFLP se verificaron con electroforesis de geles de agarosa al 1.5% y 2%. En nuestro estudio, obtuvimos 2 amplicones para Suillus brevipes el amplicón 1 de 700 pb y el amplicón 2 de 600 pb. El análisis del amplicón 1 presentó 96% de similitud con S. pseudobrevipes; y los patrones de bandeo de dicho amplicón generaron bandas de 600 y 100 pb con AluI, de 270, 230 y 200 pb con HinfI y de 490, 190 y 100 pb con BsuR. Para I. splendens se obtuvo un amplicón de 600 pb y 99 % de similitud con una especie de Dothideomycete, debido al resultado obtenido se optó por no utilizar dicha información, ya que no corresponde con la especie de HECM que se tiene caracterizada. En cuanto a S. glandulosipes se obtuvo un amplicón de 780 pb con 77% de similitud con S. pungens, a pesar del bajo porcentaje observado es la única especie a la que más se parece la secuencia. Estos resultados pueden estar indicando que las especies de este estudio y que han sido recolectadas en México pueden corresponder con especies no descritas aún. Por otro lado, los perfiles que se obtuvieron fueron de 650 y 130 pb con AluI, de 250, 200, 150, 100 y 80 pb con HinfI y de 490, 190 y 100 pb con BsuRI. Finalmente, el amplicón para I. dulcamara fue de 850 pb; el análisis presentó 92% de similitud con I. dulcamara y los patrones de

bandeo generados fueron de 380, 270 y 200 pb con AluI, de 650 y 130 pb BsuRI, y de 460 y 390 pb para EcoRI. Dichos perfiles, al ser diferentes para cada especie probada, dan evidencia de que los marcadores de este tipo son adecuados para la determinación de la especie de este grupo de hongos, aunque es necesario confirmar que sea reproducible con ejemplares de la misma especie.