Generación del vector de silenciamiento para genes que codifican para lacasas de Pleurotus ostreatus

Abstract

Pleurotus ostreatus es una de las setas comestibles más importantes para el hombre debido a que posee altos valores nutritivos y a que actualmente es una de las especies de las que se obtienen algunos metabolitos de interés dentro de la industria alimentaria, papelera, cosmética y en áreas de biorremediación, entre otras. Este hongo posee la capacidad de degradar a la lignina a través de un complejo enzimático constituido por peroxidasas y fenoloxidasas, a estas últimas pertenecen las lacasas, las cuales son enzimas secretadas en múltiples isoenzimas, dependiendo de la especie que las produce y las condiciones de cultivo del organismo, lo que constituye una fuente de enzimas con cualidades catalíticas diversas, con varias aplicaciones biotecnológicas. Una de las funciones más estudiada y discutida de las lacasas es, justamente, la degradación del polímero de lignina. Por otra parte, en otros hongos, se ha descrito su implicación en procesos que no tienen que ver con degradación, por ejemplo, Aspergillus nidulans posee al menos dos lacasas, una de ellas que se cree está implicada en la coloración verde de los conidios y la otra en la morfogénesis y en procesos de esporulación. Por otra parte, se ha reportado que están involucradas en la síntesis de melanina y otros pigmentos en Aspergillus nidulans, la formación del cuerpo fructífero en Lentinula edodes y Coprinus congregatus, así como en la, formación de los primordios en Schizophyllum commune y la formación de rizomorfos en Armillaria sp. Sin embargo, aún no se han comprobado todas estas funciones, puesto que estos estudios se han realizado de manera indirecta, es decir, que evalúan al mismo tiempo otros efectos que no permiten aclarar terminantemente cual es la función fisiológica que presenta la enzima en el hongo. Sin embargo a través de técnicas moleculares, tales como la inactivación o silenciamiento de los genes de interés se puede llegar a conocer la función de dicha enzima. Para ello se ha utilizado ARN de interferencia (ARNi), el cual es un mecanismo que inhibe la expresión de genes específicos en la fase post-transcripcional, permitiendo así la evaluación de cambios en la morfología y otros efectos en el organismo, este tipo de estudios dan la pauta para poner en práctica esta metodología específicamente para el silenciamiento de genes codificantes de lacasas en Pleurotus ostreatus. Para poder aplicar esta técnica, se debe construir un vector de silenciamiento específico para el gen que se desee silenciar, cuyos elementos importantes incluyen aquéllos que lo hacen v replicarse e integrarse al genoma eucarionte, los promotores empleados, el sitio o sitios de cortes, así como un marcador de resistencia para el organismo que se desee transformar para poder seleccionar sólo a las cepas transformantes y un fragmento específico muy conservado de genes de lacasa para dirigir el silenciamiento. Para ello se cuenta con información obtenida de numerosos estudios en los que han identificado los genes que codifican para estas enzimas, de la cual se ha podido obtener el fragmento indicado. En el presente estudio se construyó el vector pRNAi-LAC con un fragmento de 300 pares de bases aproximadamente, correspondientes con una zona exónica de genes muy conservada, que codifica para una gran variedad de lacasas en hongos y en otros organismos, lo que lo hace específico para el silenciamiento de genes que codifican para dicha enzima. Cabe mencionar que dicho vector cuenta con un marcador de resistencia a fleomicina, que permite la selección de las transformantes, presenta promotores Pgpd y Ppki, los cuales son considerados promotores fuertes debido a que preceden de genes muy importantes que codifican para enzimas de rutas metabólicas que se encuentran en la mayoría de los organismos y son reconocidos por factores de transcripción generalistas, lo que proporciona ventajas al diseño de este vector respecto a otros vectores. También presenta un único sitio de corte para NcoI, lo cual facilita la introducción del gen de interés.