Determinación de la actividad enzimática peroxidasa y polifenoloxidasa extracelular de cinco cepas de hongos ectomicorrizógenos en cultivo in-vitro

Abstract

La ectomicorriza es la simbiosis típicamente formada entre las raíces de plantas perenes leñosas y algunos hongos especializados del suelo. Esta asociación constituye la comunidad microbiana dominante en los suelos de los ecosistemas templados y boreales, jugando un papel clave en la nutrición de los árboles forestales, por lo que el establecimiento de la asociación se convierte en un proceso central para una gran variedad de plantas en lo que se refiere a la captación de nutrimentos del suelo. Es generalmente aceptado que el carácter ectomicorrizógeno evolucionó de manera convergente en varios linajes de hongos saprófitos por lo cual se considera que la capacidad de degradar compuestos orgánicos, entre ellos la lignina, mediante la producción de enzimas extracelulares como la lacasa, manganeso peroxidasa y tirosinasa, ha sido conservada. Sin embargo, las implicaciones ecológicas que se originan de la manifestación de dichas actividades enzimáticas aún son discutidas. Considerando que se asume que los hongos ectomicorrizógenos (HEM) tienen la capacidad de desarrollarse como saprófitos facultativos, estas actividades enzimáticas les proveen la capacidad de degradar materia muerta y se ha sugerido que se encuentran relacionadas con la degradación de las paredes celulares de la raíz, durante el establecimiento de la simbiosis. En modelos fúngicos saprófitos se ha observado que la producción de dichas enzimas puede ser inducible, por lo que se sugiere que la lignina, componente estructural de las raíces, pudiera servir como agente inductor para la producción enzimática en los HEM también. Así pues, se utilizó harina de raíz adicionada al medio de cultivo para evaluar si sus componentes estructurales tienen algún efecto sobre la producción de enzimas peroxidasa y/o polifenoloxidasa en cinco cepas de HEM. La harina de raíz se obtuvo a partir de las raíces de plántulas de Pinus hartwegii de dos años de edad, las cuales fueron limpiadas, deshidratadas y trituradas en un mortero. Con la finalidad de complementar la información de las cepas de estudio, se realizó su identificación molecular mediante el uso de las secuencias de la región ITS del ADNr que fueron comparadas con las depositadas en el Gene Bank. Posteriormente, en un arreglo completamente aleatorizado con dos factores se realizó una evaluación cualitativa para determinar la presencia de actividad enzimática, considerando dos grupos experimentales un tratamiento sin raíz y uno adicionado con harina de raíz de Pinus hartwegii (n= 6) además de un control. Se registraron los cambios en la coloración del medio de cultivo, comparando éstos con el control experimental y con un control positivo, además del diámetro de la colonia y del halo formado (en mm). Con esta información, se calculó el índice de potencia enzimática así como la velocidad media de crecimiento de las colonias. Finalmente, la evaluación cuantitativa se llevó a cabo en cultivos en medio líquido con agitación, arreglada en un diseño trifactorial en boques al azar y considerando los dos mismos grupos experimentales, un tratamiento sin raíz y uno adicionado con harina de raíz de Pinus hartwegii (n= 9). Se evaluaron 4 tiempos, día cero, 10, 20 y 30 de cultivo y cada unidad experimental fue filtrada al vacío. El micelio fue recuperado para la cuantificación de biomasa, en el extracto crudo enzimático obtenido se valoró la producción de enzimas ligninolíticas, de proteínas solubles y el consumo de sustrato. Se logró la ubicación taxonómica de las cepas estudiadas dentro de complejos de especies. Sin embargo, para precisar su identidad será necesario realizar las correspondientes filogenias. En cuanto a la evaluación cualitativa, no fue posible determinar las actividades enzimáticas evaluadas en la cepa Suillus KL2296. Además, ninguna de las cepas estudiadas manifestó la producción de actividad tirosinasa extracelular. Los resultados indican que bajo las condiciones evaluadas, la adición de harina de raíz al medio de cultivo no tiene un efecto significativo sobre la producción de enzimas MnP y lacasa.