Degradación de di(2-etilhexil) ftalato por hongos comestibles desarrollados en fermentación sumergida

Abstract

Los ftalatos son ésteres derivados del ácido ftálico y se utilizan como plastificantes en la elaboración de plásticos. El di(2-etilhexil) ftalato (DEHF) es ampliamente utilizado a nivel mundial, sin embargo, dado que este compuesto no se une a la matriz polimérica del plástico, con el paso del tiempo migra al ambiente, provocando daños a la salud de diferentes organismos y generando problemas de bioacumulación (Wensing et al. 2005. Lowell Center for Sustainable Production, 2011). Se ha reportado que algunos hongos comestibles poseen la capacidad de degradar una amplia variedad de compuestos aromáticos, entre los cuales se encuentran los ftalatos (Sánchez, 2006; 2009), por tal motivo el objetivo de este trabajo fue evaluar en fermentación sumergida la degradación de diferentes concentraciones de DEHF por tres cepas de hongos comestibles (Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus ATCC32783 y Pleurotus pulmonarius) y el efecto de dicho proceso sobre la velocidad específica de crecimiento (µ), producción de biomasa máxima (Xmax), cuantificación de glucosa presente en el medio, perfil de pH del medio, perfil enzimático de lacasas y esterasas y los rendimientos enzimáticos (Emax, YE/X, qp y P) que conlleva su determinación. Las cepas fúngicas se desarrollaron en agar extracto de malta (EMA), formando colonias en la periferia que se emplearon como inóculos. Éstas crecieron en matraces de 125 mL que contenían 55 mL de medio mineral suplementado con extracto de levadura y glucosa. A este medio se le adicionaron las concentraciones de1500 y 2000 mg de DEHF/L. En los cultivos con DEHF se adicionó Tween80 al 0.04 %. En todos los casos, el medio de cultivo sin adición de ftalato (SAF) fue utilizado como testigo (modificado de Córdoba-Sosa et al. 2014). Las fermentaciones de L. edodes se incubaron a 25 oC por 37 días y las de P. ostreatus ATCC32783 y P. pulmonarius se incubaron a 28 °C por 24 y 23 días respectivamente. Ya inoculadas, las fermentaciones se mantuvieron en agitación a 120 rpm. Se hicieron tres réplicas de los matraces por día. Para L. edodes la toma de muestras se realizó cada 48 horas a partir del día de incubación y hasta el día 20, a partir de este día y hasta el día 37 los muestreos se hicieron cada 24 horas. En las especies del género Pleurotus, los hongos se desarrollaron durante las primeras 72 h de cultivo y posteriormente se tomó la primera muestra, los muestreos subsecuentes se realizaron cada 24 h. Se obtuvo el sobrenadante de cada matraz por filtrado y retención de la biomasa. Se guardaron las cantidades necesarias en tubos Eppendorf para posteriores análisis. La producción de biomasa se determinó a través del método de peso seco para obtener los valores de µ y Xmax mediante el uso de la ecuación logística. Los cambios de pH en el medio se determinaron con un potenciómetro. La cuantificación de la glucosa en el medio se obtuvo por el método de DNS. Para la actividad de lacasas y esterasas se usó 2,6-dimetoxifenol y p-nitrofenil butirato como sustratos respectivamente. Los rendimientos enzimáticos YE/X, qp y P se determinaron mediante la áctividad máxima (Emax) de la enzima. Los resultados mostraron que L. edodes es el hongo con menor µ (0.0074 h-1 en 0 y 1500 mg de DEHF/L y 0.0070 h-1 en 2000 mg de DEHF/L) , en cada uno de los tratamientos en comparación con las otras dos cepas, tardando así, más tiempo en alcanzar su fase estacionaria (33-34 d). P. ostreatus ATCC32783 presentó la mayor Xmax (7.1054 g/L en medio SAF, 8.3781 g/L en 1500 mg de DEHF/L y 9.2901 g/L en 2000 mg de DEHF/L) en los tres medios. En las tres cepas los valores más altos de Xmax se presentaron en el tratamiento con mayor concentración de DEHF. En L. edodes el DEHF se degradó hasta mono(2-etilhexil) ftalatoMEHF pasando por la formación de dodecil octil ftalato, diheptil ftalato, ditridecil ftalato y monobutil ftalato (MBF). En P. ostreatus ATCC32783 el DEHF se degradó en ciclohexil 2-pentil ftalato, diisooctil ftalato, di(2- metilbutil) ftalato y MEHF. En P. pulmonarius el DEHF se degradó hasta MEHF a través de la formación de 2-etilhexil hexil ftalato, 2-pentil ftalato, di(2-metilbutil) ftalato y MEHF. Las tres cepas fueron capaces de hidrolizar selectivamente un enlace del DEHF para formar MEHF y de convertir las largas cadenas de DEHF en cadenas más cortas o eliminar su ramificación quitando grupos etilo. Durante el proceso de degradación se formaron metabolitos (alcoholes, ácidos orgánicos y compuestos aminados) que afectaron los niveles de pH en cada una de las cepas. Se concluyó que las cepas de hongos comestibles L. edodes, P. ostreatus ATCC32783 y P. pulmonarius son capaces de utilizar parcialmente el DEHF como fuente de carbono y energía a través de algunos metabolitos formados durante este proceso, provocando un incremento significativo en la producción de biomasa. Sin embargo, ninguna de las tres cepas pudo degradar este compuesto hasta AF. Este es el primer reporte en el que se utiliza L. edodes y P. pulmonarius para crecer en presencia de DEHF y degradarlo. No hay represión catabólica en ninguna cepa, que ya las tres utilizan la glucosa como principal fuente de carbono y energía en los tres tratamientos. En las tres cepas, se observa que las lacasas y esterasas extracelulares con actividad catalítica observada en los tres medios son constitutivas e inducibles.