Resistencia/tolerancia de cinco cepas bacterianas que crecen en presencia de compuestos azo y análisis preliminar de su ADN plasmídico

Abstract

Las bacterias son los organismos más abundantes y ubicuos del planeta, habitan en sitios bajo condiciones extremas y con altos grados de perturbación, sitios contaminados, suelo, agua y aire. Esta capacidad de subsistencia en ambientes hostiles está relacionada con el despliegue de distintos mecanismos de tolerancia y/o resistencia que le ayudan a contener el efecto dañino de diferentes compuestos presentes en su hábitat. En este sentido, podemos definir a la resistencia como la capacidad que poseen los organismos para sobrevivir en presencia de un agente de presión sin que el organismo vea afectadas sus actividades metabólicas. El caso contrario, en el que los organismos habitan ambientes en presencia de un factor de presión y esto les obliga a cesar su crecimiento y reproducción para lograr subsistir en el medio, es conocido como tolerancia. En algunos organismos, estos mecanismos son otorgados y se encuentran codificados en el ADN plasmídico, que son moléculas de ADN extra cromosómico, con la capacidad de auto replicación independiente a la división celular. Un ejemplo de sustancias tóxicas que son depositadas en el ambiente y que generan un medio hostil para la sobrevivencia de los organismos, son los colorantes del tipo azo; dichas sustancias son productos de desecho de industrias como las del papel, textiles, cosméticas y alimenticias, que terminan depositadas en los suelos de los efluentes circundantes a ellos y que imponen un factor selectivo para el crecimiento de algunos organismos. Las cepas bacterianas seleccionadas para la realización del presente estudio, han sido aisladas a partir de efluentes de desecho (que incluyen a los de la industria textil) y son capaces de crecer en presencia de los colorantes azo de grado analítico rojo Congo y rojo de metilo, que son también usados en este tipo de industrias. El objetivo de este trabajo fue determinar si las cepas bacterianas seleccionadas poseen mecanismos de tolerancia y/o de resistencia al crecer en presencia de estos dos colorantes y si es el ADN plasmídico quien les otorga esta capacidad de subsistencia sobre ellos. Durante el desarrollo de la investigación se realizó la identificación molecular de las cepas aisladas, utilizando la secuencia de la región 16S del ADNr para su análisis comparativo con las secuencias depositadas en las bases de datos mundiales (GeneBank y Greengenes). Las pruebas de tolerancia se diseñaron para determinar la capacidad que las cepas poseen para crecer en un medio con una fuente de carbono de fácil asimilación, adicionado con el colorante, mientras que las pruebas de resistencia tuvieron como objetivo determinar cuáles de las cepas eran capaces de crecer utilizando al compuesto azo como única fuente de carbono. En ambas pruebas los parámetros determinados fueron la densidad óptica (DO600) y el porcentaje de desaparición de los colorantes mediante espectrofotometría, evaluados en micro cultivos líquidos incubados durante 96 h a 30 °C. Para confirmar la participación del ADN plasmídico en la capacidad de las cepas para crecer en presencia de dichos colorantes, se realizó el curado de las mismas, despojándolas de sus plásmidos y sometiéndolas nuevamente a crecimiento usando las pruebas de tolerancia y de resistencia. Finalmente, el material plasmídico obtenido fue linealizado mediante digestión enzimática, con el fin de determinar el número y tamaño de los plásmidos. Para el análisis preliminar del ADN plasmídico, los plásmidos fueron digeridos enzimáticamente con el fin de clonar sus fragmentos en un vector y secuenciarlos, para posteriormente, realizar un análisis comparativo con la información de bases de datos mundiales y determinar, en lo posible, los genes que se encuentran en dichos plásmidos. Las cepas aisladas fueron identificadas como Acidovorax Anthurii (similitud del 99% con GenBank: KP641171.1), Ralstonia pikettii (similitud del 99% con GenBank: CP006668.1), Agrobacterium sp. (99% de similitud con GenBank: KT894723.1), Ralstonia sp. (99% de similitud con GenBank: AY238507.1) y Cupravidus sp. (99% similitud con GenBank: KT461854.1). Se pudo observar, que las cuatro primeras cepas fueron sólo tolerantes a crecer en presencia de los colorantes azo en medio LB, alcanzando un crecimiento máximo de 5.05e+08 células/mL y un porcentaje de decoloración entre el 91% y 95% durante las 96 h del cultivo. Sólo Cupravidus sp. mostró ser resistente al rojo Congo, alcanzando un máximo crecimiento de 1.83e+08 células/mL y un 90.74% de decoloración, durante las 96 h del cultivo. Se logró determinar que el ADN plasmídico presente en las cepas no les otorga la capacidad de crecer en presencia de estos colorantes, al obtener valores similares en los parámetros de crecimiento con las cepas curadas con respecto a los observados en los cultivos realizados con las cepas que mantienen sus plásmidos. Para el análisis de los elementos génicos del material plasmídico se utilizó solamente el ADN plasmídico de la cepa Acidovorax anthurii, debido a que en dicha cepa, si fue posible definir la presencia de sólo un plásmido y su tamaño, con la gama de enzimas de restricción probadas. Se determinó que el plásmido que posee tiene un tamaño de aproximadamente 18,601 pb y los fragmentos que pudieron ser secuenciados poseen 92% de similitud con un fragmento de un gen de resistencia a ampicilina, perteneciente a un plásmido de la cepa Klebsiella pneumonie plncR_DHQ1300920 de 70,830 pb. Al respecto, se ha sugerido que estos genes suelen ser útiles a las bacterias para su subsistencia haciendo frente a sus competidores de nicho, los cuales pueden secretar alguna especie de agentes antimicrobianos.