Efecto de la accividad proteasa sobre la actividad de lacasas extracelulares producidas por Pleurotus ostreatus

Abstract

Las lacasas, por su enorme capacidad catalítica, son enzimas útiles en diversos procesos industriales. Estas enzimas son secretadas por hongos de podredumbre blanca, como Pleurotus ostreatus, en cantidad y actividad notables, siendo recursos prometedores para su producción masiva. No obstante, se ha evaluado su producción bajo distintas condiciones, incluyendo la via recombinante, sin alcanzar resultados satisfactorios. Al respecto, diferentes autores sugieren que el abatimiento de la actividad de las lacasas en extractos celulares de P. ostreatus, puede deberse a la acción de proteasas (ácidas, neutras o alcalinas) a través de algún mecanismo de regulación enzimática. Sin embargo, aún se desconoce cuáles de estos tipos de proteasas son producidas y excretadas por este hongo y sobre todo, cuáles afectan con su acción a las lacasas. Por esta razón, el presente estudio tiene como objetivos caracterizar la presencia de isoenzimas de lacasa, así como de los tres tipos de proteasas, producidas extracelularmente por la cepa PoB de P. ostreatus, en cultivo en medio líquido y determinar cuál es la influencia que las proteasas ejercen sobre la actividad de las lacasas, mediante el uso de la inhibición de la actividad de proteasas específicas. Esta información permitirá correlacionar el efecto entre ellas, con la intención de ofrecer otro tipo de estrategias que, a nivel bioquímico o molecular, contribuyan a incrementar la producción de lacasas. Para llevar a cabo la caracterización de la producción de lacasas y proteasas, se realizó el cultivo de la cepa PoB de Pleurotus ostreatus en medio mineral líquido durante 20 días, empleando glucosa como fuente de carbono y extracto de levadura como fuente de nitrógeno. Durante el cultivo se monitoreó el valor de pH del medio, además de la evaluación de parámetros tales como: biomasa producida, consumo de sustrato, actividades extracelulares de lacasa y proteasa. Adicionalmente, se realizaron zimogramas para conocer el perfil de isoenzimas presentes en el cultivo, para ambos tipos de enzimas. Para evaluar el efecto que cada tipo de proteasas ejerce sobre la actividad de lacasas extracelulares, se llevaron a cabo cultivos en los que se incluyeron los inhibidores específicos para cada tipo de proteasas de manera independiente (PMSF, EDTA, Pepstatin A), además de un cultivo en el que se incluyó un coctel de inhibidores de todos los tipos de proteasas, y un cultivo sin inhibidores como control. Se determinaron nuevamente los parámetros antes mencionados. Como resultado de la caracterización, se obtuvo una Xmax de 6.465 g/L a las 384 h con una y de 0.02 h'. Debido a que el medio de cultivo se amortiguó con fosfato de potasio, el pH tuvo poca variación (6.87 - 6.33) durante el cultivo, lo que mantuvo estable la inducción de las enzimas por este factor. Se observó un consumo parcial del sustrato, siendo más importante a partir de las 264 h de cultivo, coincidente con el tiempo en que se llevaba a cabo el crecimiento exponencial de la biomasa. La mayor actividad de lacasas fue de 15.97 U/L a las 480 h del cultivo. Se observaron dos isoenzimas de lacasa a la altura de los marcadores con peso molecular de 35 y 55 kDa, a partir de las 72 h y que permanecieron hasta el final del cultivo. En cuanto a las proteasas, se obtuvieron actividades de los tres tipos durante todo el cultivo y se detectaron al menos cuatro isoenzimas de proteasas neutras, ubicadas entre los marcadores de peso molecular de 70 y 130 kDa. Para el cultivo con inhibidores para proteasas, los tratamientos no afectaron significativamente la producción de biomasa y consumo de sustrato. Los diferentes inhibidores probados (coctel, PMSF y Pepstatin A) afectan de manera positiva la actividad de lacasas, es decir, ésta aumenta al inhibirse la actividad de las proteasas en el medio de cultivo de P. ostreatus. Se concluye que las proteasas neutras y ácidas son las que particularmente afectan de manera negativa a la actividad de lacasas, debido a que a consecuencia de su inhibición, se mostró un aumento de 1.33 veces de la actividad lacasa.