Caracterización de la expresión de los genes que codifican isoenzimas de lacasa producidas por Pleurotus ostreatus cultivado sobre paja de trigo

Abstract

En la actualidad el empleo de enzimas de origen microbiano está teniendo mayor importancia debido a las múltiples aplicaciones a nivel industrial y en procesos de biorremediación tal es el caso de la enzima lacasa, la cual es capaz de degradar una gran variedad de compuestos tóxicos que se encuentran presentes en la mayoría de los efluentes industriales. Son diversos los organismos que producen esta enzima, no obstante, en numerosos estudios se ha reportado una buena producción de enzimas lacasas a partir de basidiomicetos, principalmente, en Pleurotus ostreatus donde éstas enzimas tienen mejores actividades. La producción de lacasas en hongos varía dependiendo de la especie, las condiciones de cultivo, incluso de la cepa con la que se trabaja y se presenta en múltiples isoenzimas con actividad variable, esto supone, una expresión diferencial de los genes que las codifican. En este trabajo se consideró importante evaluar en qué número y de qué manera se presentan las isoenzimas de lacasa producidas por Pleurotus ostreatus cultivado sobre paja de trigo como medio sólido biodegradable, un soporte que representa el ambiente natural de desarrollo del hongo, debido a que los estudios de producción de éstas enzimas se han hecho principalmente en medios líquidos sintéticos. Lo anterior con el objeto de obtener información que permita evaluar la conveniencia de producción de lacasas en fermentación en medio sólido. Además, conocer los patrones de expresión de los genes que codifican para enzimas lacasas bajo estas condiciones aporta conocimiento básico a estudios posteriores sobre la participación fisiológica de las enzimas lacasas en Pleurotus ostreatus, y la evaluación de la naturaleza de los genes. Durante su desarrollo se identificó la presencia de hasta 4 isoenzimas de aproximadamente 30, 34, 37 y 50 kDa que aparecen de manera diferencial en las distintas etapas de cultivo evaluadas tanto extracelular como intracelularmente y desde las primeras 24 h. A pesar de que no se establecen claramente las etapas de crecimiento del hongo se pudo observar que la isoenzima de mayor peso molecular se presenta de manera constante a partir de las 96 h y hasta el final del cultivo, es decir, durante la invasión acelerada y la invasión total de la paja por el micelio del hongo en los cristalizadores, lo que no sucede con el resto de ellas que se presentan principalmente durante el crecimiento acelerado del hongo. La máxima actividad de lacasas alcanzada por el extracto crudo enzimático fue de 4.821 U/g de sustrato seco a las 120 h lo que9 refleja aparentemente una menor actividad con respecto a la actividad obtenida por el mismo hongo de una cepa IE8 pero cultivado sobre bagazo de caña que fue de 15.54 UI/g sustrato seco lo que puede deberse a la diferencia en la composición de los sustratos. La prueba de hibridación de sondas específicas para lacasas con Northern blot no reveló ningún resultado, en cambio con la obtención de ADNc a partir de RT-PCR con primers específicos para lacasas (Lac1 y Lac2), de cada uno de los puntos de muestreo se pudo observar un patrón de expresión de lacasas que mantuvo cierta correspondencia entre las bandas de ADNc con las isoenzimas en cada uno de los puntos de muestreo lo que sugiere que en estas condiciones de cultivo hay más de un gen responsable de la aparición de las isoenzimas. Este patrón de expresión obtenido debe ser validado mediante la obtención de las secuencias de las bandas de ADNc.